明建文帝即位后，将方孝儒招至南京，委以翰林侍讲学士之职。建文帝年纪尚轻，缺乏治国治军的本领。因方孝儒是他的老师，更受到百般信赖和倚重，“国家大事，辄以咨之”。方孝儒对建文帝赤胆忠心，全力扶持。建文帝害怕他的叔叔们王权过大，拥兵为患，就采用齐秦、黄子澄的削藩建议，但遭到以燕王朱棣为首的诸王的反对。方孝儒替建文帝起草了一系列征讨燕王的诏书和檄文。
朱棣在攻下南京后，篡得大明皇位。迫令方孝儒为他起草即位昭书。方孝儒反对朱棣篡权，宁死不从，掷笔于地说：“死即死耳，诏书不草！”燕王大声说：“诏不草，灭汝九族！”方孝儒针锋相对的说：“莫说九族，十族何妨！”朱棣又反复劝说方孝儒：“不要自找苦吃，我欲效法周公辅佐成王。”方孝孺依然还是不屈服，他说“好，我写！”他从地上拾起笔来，大书四字“燕贼篡位”。
朱棣大怒，他命人拿刀来从方孝孺的嘴角直割到耳旁，并将他投入监狱。见方孝孺仍不屈服，朱棣就下令把方孝孺在午门内凌迟处死。
相传明宫午朝门内丹墀上的血迹石，即为方孝儒鲜血所溅而成。古代帝王处死大臣，一般都在刑部天牢、闹市行刑，或者推出午门外斩首，在午门内杀人是没有先例的。由此可见朱棣对方孝儒怨恨之深。方孝儒在就义前，作绝命赋道：“天降乱离兮，孰知其由；奸臣得计兮，谋国用犹；忠臣发愤兮，血泪交流；以此殉君兮，抑又可求？呜呼哀哉，庶我不尤！”朱棣处死方孝儒后，仍不解心头之恨，下令灭他十族。方孝孺的九族加上他的朋友、门生也算作一族，共873人，全部处死，行刑就达7日之久。
方孝儒宁死不屈的高尚情操，受到人们的尊敬。早在明代万历年间，就有人为他建神情祠、树亭。著名戏曲家汤显祖还曾为他树了墓碑。但是，当时县令邵甲害怕因此获罪，下令将它们都捣毁了。清代顺治年间，又在雨花台西麓重建方孝儒祠、墓，分为两处。嘉庆二年，方孝儒族人方昂来谒墓，又重修了祠和墓，并由著名的桐城学派者姚□作记。
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